研究背景

模仿细胞外基质（ECM）重要特征的纳米纤维支架，为组织再生提供了一种有前途的策略。在本文中，研究者开发了一种由天然蚕丝蛋白纳米纤维（SNFs）和糖胺聚糖透明质酸（HA）组成的仿生纳米纤维支架。SNFs可以大规模组装成密度低、形状理想的纳米纤维气凝胶支架，HA的存在显著提高蚕丝纳米纤维的亲水性和生物活性，使其具有超高孔隙率、自然生物活性和水环境中结构稳定性。蚕丝纳米纤维支架还模仿了ECM的层次结构，为细胞的粘附和增殖提供了有利的微环境，这种在结构和功能上仿生的系统是一种很有前途的组织工程支架。

研究内容

在这项研究中，受ECM独特结构和生物活性组成的启发，研究团队开发了一种由SNF和HA组成的结构和功能仿生气凝胶支架，并展示了它们在生物医学应用中的潜力。研究结果表明，该支架可在蛋白酶/透明质酸酶溶液中保持其整体形状。此外，SNF气凝胶支架表现出优异的生物相容性和细胞浸润性。这些在结构和功能上仿生生物材料拓展了SNFs的应用场景，使其适用于湿法应用，例如用于细胞培养和组织工程的3D基质。 

图1 HA组装的SNF气凝胶支架的制备和结构稳定性

机械分解后均匀的SNF浆料（图1B）通过冷冻干燥得到低密度SNF支架，并且可以很容易地制造出理想的形状（图1C）。而这种支架在蒸馏水中浸泡后，迅速膨胀并失去其原始形状，在水环境中的结构稳定性较差（图1I)。

为了提高SNF支架的结构稳定性和力学性能，采用HA调控SNF装配。将SNFs和HA混合，通过EDC交联和冷冻干燥制备3D纳米纤维气凝胶支架。SNF支架在浸入水中时保持了结构完整性和原始形状，表明SNFs之间的相互作用增强。HA大分子的−COOH基团可以与蚕丝纳米纤维表面氨基（−NH2）形成酰胺键（−CONH−）（图1D、E）。通过化学交联，将HA大分子接枝到SNFs的表面。此外，HA链之间酯基的形成将进一步增强SNF气凝胶在水中的稳定性。

为了进一步探究HA组装的SNF气凝胶支架在水环境中的稳定性，将其置于PBS中，支架可以保持整体形状13周，显示出优异的结构稳定性。在蛋白酶/透明质酸酶溶液中，SNF 气凝胶在 2 周后仍保持其整体形状。添加了10.0% HA的SNF支架能够在蛋白酶/透明质酸酶系统中保持结构完整性3周（图1J）。SNF支架在蛋白酶/透明质酸酶溶液中的结构稳定性为其在体内应用提供了可行性。

图2 HA修饰对SNFs的影响

为了检测HA是否成功化学接枝到纳米纤维表面，以及HA功能化对结构和细胞行为的影响，研究了SNF膜的接触角和细胞活力。将以不同量HA改性的SNFs彻底冲洗并制备成膜（图2A）。HA修饰后的SNF膜的接触角显著减小，表明HA已成功化学接枝到纳米纤维表面（图2C）。当反应溶液的HA比达到SNF重量的10.0%时，接触角没有显着变化，表明达到最大接枝含量。

采用CCK-8试剂盒和荧光染色检测细胞活力。如图2D，修饰后的SNF膜表面细胞表现出快速增殖，表明其优异的生物相容性。改性SNF膜的细胞粘附和增殖显著高于纯SNF膜。图2E显示了BMSCs在不同SNF薄膜上的荧光图像。在SNF膜的表面，细胞显示出完全扩散。用10.0% HA修饰的SNF膜上的细胞扩散似乎比其他两组更强，表明HA含量对细胞生长的积极影响。

图3 HA组装的SNF气凝胶支架的结构表征

研究团队还探索了HA比率对SNF支架形貌、孔隙率和比表面积的影响。图3结果表明，冻干的SNF海绵呈现多孔结构，孔径范围为100-300μm（图3A-D）。HA添加后，纳米纤维形貌未被破坏，SNFs组装成蓬松的纳米纤维状ECM样结构。随着HA比率增加，孔隙率下降。由于超低的纳米纤维浓度（0.5 % SNF浆料），2.5 %-10.0 %的HA比例对SNF支架的密度和孔隙率的影响较弱。使用BET进一步测量SNF支架的比表面积。如图所示图3F，HA比率的增加，比表面积逐渐减小。当HA比值从5.0 %提高到10.0 %时，比表面积仅略有减少，维持117 m2/g。SNF支架的水结合能力通过溶胀率和水保留率来检测。SNF支架的水结合能力随着HA比值的增加而增加（图3G，H）。在天然ECM中，糖胺聚糖为细胞提供类似水凝胶的微环境。HA极大地提高了SNF支架的亲水性和水结合能力，可以为改善细胞生长和组织再生提供高度水合的微环境。 

图4 HA组装的SNF气凝胶支架的机械性能

采用压缩试验检测HA添加量对SNF支架力学性能的影响。图4显示了纳米纤维支架的可压缩性。在被压缩500倍于自身重量后，SNF气凝胶恢复到其原始形状（图4A）。与再生丝素蛋白纳米纤维相比，天然SNFs保留了天然丝的原始分层结构和高机械性能。HA的加入通过增强SNFs之间的相互作用，显著提高了复合材料支架的力学性能（图4B-E）。随着 HA 从 2.5 %增加到 10.0 %，压缩强度从 11.1 kPa在 80 % 应变下增加到 13.9 kPa，SNF支架的模量也相应增加（图4G)。

水合气凝胶支架在80 %应变下的水下压缩应力-应变曲线如下图4H。HA组装的SNF气凝胶支架可以承受较大的压缩应变，在水环境中不会出现任何裂纹。随着HA比率增加，80 %应变下的压缩强度和模量也呈增加趋势（图4I,J）。上述结果表明，添加少量HA不仅赋予了SNF气凝胶在水中的结构稳定性，而且增强了其力学性能。

图5 HA组装的SNF气凝胶支架上的细胞活力

采用CCK-8试剂盒和荧光染色检测成骨细胞（图5B）活力。接种一天后，细胞在3D支架内实现了良好的细胞粘附和存活。随着培养时间的延长，支架内的细胞数量增加，第7天（图5D）荧光图像表明，SNFs能够支持细胞的粘附和快速增殖。

总结与展望

在这项研究中，研究团队开发了一种由蛋白质纳米纤维和糖胺聚糖组成的仿生纳米纤维支架。纳米纤维气凝胶支架表现出超低密度、超高孔隙率和带有微孔的孔壁结构，有利于传质，实现有效的营养供应、氧扩散和代谢废物清除。纳米纤维气凝胶支架不仅模仿了ECM的组成，而且模仿了ECM的层次结构，为细胞的粘附和增殖提供了有利的微环境。可以预见，这种在结构和功能上仿生的系统可以作为优越的组织工程生物医学材料。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128762