摘要

为了减轻化疗药物对健康组织的不良影响，一种有前景的新方法是将声动力疗法与局部化疗相结合，以提高抗癌药物的治疗效果。在本研究中，引入了一种多功能原位壳聚糖水凝胶（CS），其中包含负载阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒（DOXSFNPs）和 CuO/TiO₂纳米颗粒（CTNPs）用于联合治疗。所制备的 DOXSFNPs 粒径为257±6nm，zeta 电位为-14.3±1.8mV，载药率高达12.38±1.73%。观察到 DOX 从 DOXSF2/CS2 中的 pH 依赖性控释比从 DOX/CS2 中更为显著。MTT 结果表明，CT/CS2 在超声辐射（US）下的毒性呈剂量依赖性。研究结果显示，治疗后活性氧（ROS）产量增加了 1.83 倍，CT3-DOXSF2/CS2-US 的 IC50 相比 CT3/DOXSF2/CS2 降低了58%。体内实验结果和组织病理学染色表明，CT3/DOXSF2/CS2-US 治疗组的肿瘤生长抑制率最高，达到约83.65%。这些发现强调了该方法在最小化化疗不良影响的同时最大化治疗效果的潜力，为癌症治疗领域做出了有价值的贡献。

研究内容

该研究旨在开发一种基于多糖的具有适当物理和化学性质的生物活性水凝胶，用于在乳腺癌治疗中结合化疗和 SDT。特别研究了负载 DOX 的 SF - NPs（DOXSF/CS）的 CS 水凝胶对化疗药物的控释潜力。因此，该研究首先将 DOX 负载到 SFNPs 中，然后将 DOX - SFNPs 和 CuO - TiO₂纳米颗粒（CTNPs）分散在 CS 水凝胶基质（CT - DOXSF/CS）中，以制备具有合适生物学和机械性能的所需水凝胶。对制备的水凝胶的化学结构、溶胀率、降解率、机械和流变学性能以及细胞相容性进行了全面研究。该研究在体外和体内评估了这些水凝胶的抗癌效果。（Scheme 1）

Scheme1 CT-DOXSF/CS水凝胶作用机制及其在4T1肿瘤模型小鼠中化疗-SDT联合治疗示意图

丝素蛋白纳米颗粒（SFNPs）不仅稳定性高、无毒，还能实现药物的可控释放。阿霉素 “搭乘” SFNPs 这趟 “列车”，被精准输送到肿瘤组织。经检测，制备的 DOXSFNPs 粒径为257±6nm，zeta电位为 -14.3±1.8mV，载药率高达 12.38±1.73%。此外，TNPs和CTNPs的EDAX结果表明，在二氧化钛结构中加入氧化铜后，Cu重量百分比增加到1.62 %，表明CT纳米颗粒的合成成功。XRD 表明合成的TiO₂以锐钛矿相为主并含少量金红石相，CTNPs 出现与CuO衍射峰 ；FTIR 分析了其化学组成但CuO在特定区域特征峰不明显；用 DCFH - DA 检测发现 CTNPs 产生的 ROS 显著多于 TNPs，因其能增强电子 - 空穴对分离等提升 ROS 产量，后续将基于 CTNPs 研究声动力疗法对水凝胶抗肿瘤特性的影响。（图1）

图1 TNPs和CTNPs的的表征

为探究 TNPs 和 CTNPs 产生 ROS 的水平差异及其在癌症治疗中的应用，利用 DCFH-DA 作为探针检测 MCF-7 细胞系中的 ROS 水平，通过 CLSM 和 ELISA 对产生的荧光进行定量分析，结果显示 CTNPs 产生的 ROS 显著多于 TNPs。这是因为在TiO2中引入 CuO 后能产生新电子态，增强电子-空穴对分离，同时 CuO 作为助催化剂可促进电子转移、防止复合，其催化特性还能加强与氧和水分子的作用，并且铜参与的类芬顿反应也有助于产生更多 ROS。基于此，后续将利用 CTNPs 深入研究声动力疗法对水凝胶抗肿瘤特性的影响。（图2）

图2 细胞内ROS评估

FE-SEM 图像和 DLS 数据均显示 SFNPs 呈球形且尺寸分布均匀，其初始粒径为257±3nm，ζ 电位为- 20.6±2.8mV，PDI 为 0.091。负载 DOX 后，SFNPs 粒径增大至约 288±7.6nm，PDI 变为 0.130，ζ 电位转变为 14.3±1mV ，说明负载 DOX 主要影响了 SFNPs 的粒径，对 ζ 电位影响较小。（图3）

图3 SFNPs和DOXSFNPs的扫描电镜图像

接着，本研究指出 CS 的流变学特性与凝胶化温度受浓度、pH 及添加剂等因素影响，DOXSFNPs 和Cu - TiO₂纳米颗粒分别通过静电、氢键、配位及范德华力等与 CS 相互作用。经实验发现，1%（w/w）的 SFNPs 浓度对凝胶化时间最佳，增加 CT 含量会降低凝胶化温度、提升模量与交联密度，且 CT3 - SF2/CS2 样品粘弹性增强，其G'/G''比值增大，材料行为趋近弹性，CT 还可能影响复合材料拉伸强度与模量。在溶胀率方面，37°C 的 PBS 中，CS2 和 CT3 - SF2/CS2 水凝胶 24 小时内达最大溶胀，添加 SFNPs 和 CT 降低了溶胀百分比，但统计学上不显著。降解率监测显示，从第 10 天起，CT3 - SF2/CS2 样品降解速率低于 CS，这是因为 SFNPs 和 CTNPs 与 CS 的分子作用改变了水凝胶交联密度和网络结构，进而影响降解行为。（图4）

图4 水凝胶的模量、溶胀及降解

通过在 CS 中掺入 GP 得到温度敏感型水凝胶 CT3 - SF2/CS2。这种水凝胶在 25°C 时能以溶液状态用注射器注射，37°C 时发生凝胶化。FE - SEM 显示 CS2 水凝胶具连通多孔微观结构，利于水和药物或细胞渗透负载，是药物递送和组织工程的潜在材料。理想抗肿瘤水凝胶需特定孔径和孔隙率范围，实验测得 CS2 和 CT3 - SF2/CS2 冻干水凝胶平均孔径分别为 85.39±12.41μm 和 61.04±21.85μm，添加 SFNPs/CT 使孔径减小（P = 0.0038）；二者平均孔隙率分别约 79.25% 和 63.42%，CT3 - SF2/CS2 孔隙率降低是因 SF 与 CS 间形成氢键致结构致密，因其孔隙率在可接受范围，故适用于局部抗肿瘤应用。（图5）

图5 水凝胶的表征

通过溶血测试评估两者的相容性。实验结果表明，经 SF2/CS3、CT3/CS2 和 CT3 - SF2/CS2 水凝胶提取物处理的红细胞溶血活性与阴性对照相当，孵育 2 小时后，SF2/CS2 致红细胞溶血率仅 1.25±0.271%，所有水凝胶溶血率均低于 5%，符合标准。综上，所研究水凝胶与红细胞相容性佳，为其用于抗癌应用提供了有力支持。（图6）

图6 水凝胶溶血实验及TGA分析

在负载方面，SFNPs 表面与疏水性氨基酸残基的相互作用及静电引力促使 DOX 负载，且其载药量高（15% w/w 时，DL 达 12.38±1.73% ，EE 达 95.3±2.01%）。释放研究中，模拟癌细胞环境，监测 21 天发现 DOX 在 pH 7.4 时缓慢释放，pH 5.5 时大量释放，如 DOX/CS2 在 pH 5.5 释放最快，这是因为低 pH 下 CS 中氨基质子化致溶胀、DOX 离子化增强。而 pH 5.5 时 DOX 从 SFNPs 释放增加，或因酸性环境影响 SFNPs 稳定性及与 DOX 的相互作用。DOXSF2/CS2 释放速率比 DOX/CS2 慢，精准控制释放速率可减少对健康组织影响，保证癌细胞对治疗药物的持续接触 。（图7）

图7 体外DOX释放谱

接着，通过多种实验研究了含 CT 和 DOX 的水凝胶对 MCF - 7 细胞的作用及机制。MTT 实验表明，DOXSF2/CS2 的细胞毒性低于游离 DOX，体现了其对 DOX 的控释作用；CTx/CS2 对细胞无明显毒性，CT4/CS2 - US 因超声下 CT 产生 ROS 而表现出显著毒性，CTx - DOXSF2/CS2 - US 的抗癌效果比 CTx - DOXSF2/CS2 更显著，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 的 IC50 更低，且 CT 浓度增加会加大照射与未照射配方的差异。Annexin V/PI 双染法验证 MTT 结果，发现 CT3 - DOXSF2/CS2 - US 处理的细胞凋亡率更高，CT 通过产生 ROS、损伤 DNA 等诱导凋亡，DOX/CS2 比 CT3 - DOXSF2/CS2 引发的凋亡更显著，因为其 DOX 释放更快。CLSM 图像显示 CT3 - DOXSF2/CS2 中的 DOX 呈控释状态。（图8）

图8 含 CT 和 DOX 的水凝胶对 MCF - 7 细胞的作用及机制

研究人员将水凝胶皮下注射到小鼠背部，用卡尺测量体积并通过手术直接观察其在1 - 21天内的变化，发现水凝胶呈透明状且随时间逐渐变小，这是由于 CS 聚合物释放导致降解。测量水凝胶重量发现，注射 12、15、21 天后，其重量损失分别约为 43.51%、56.76%、75.94% 。对水凝胶周围组织进行组织学分析，虽在注射后第 6 天出现急性炎症，但从第 9 天开始炎症明显减轻，到第 21 天基本消失，证明该水凝胶生物相容性良好。

图9 含体外生物降解分析

通过对患有 4T1 肿瘤的雌性 BALB/c 小鼠进行实验，评估了 DOX/CS2 和 CT3 - DOXSF2/CS2 的抗肿瘤效果、全身毒性及生存率情况。在抗肿瘤效果方面，对照组肿瘤生长迅速，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 组肿瘤体积减小最明显，超声激活 CT 纳米颗粒产生的 ROS 与肿瘤体积减小有关，第 3 天起不同治疗组间陆续出现显著差异，DOX 从 DOXSFNPs 的控释提高了疗效，体现出局部递送 DOX 的优势。全身毒性实验中，静脉注射 DOX 使小鼠体重下降，而 CT3 - DOXSF2/CS2 - US 和 CT3 - DOXSF2/CS2 组体重稳定，显示出较低毒性。生存率上，CT3 - DOXSF2/CS2 组在 21 天内无死亡，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 组第 6 天出现 1 例死亡，静脉注射 DOX 组平均生存率为 18 天 。

图10 水凝胶在肿瘤小鼠中的体内性能

通过染色观察肿瘤的有丝分裂指数、核多形性和细胞凋亡水平，发现对照组的 MI 和 NP 值最高，细胞生长分裂活跃。DOX/CS2 组凋亡面积小于其他组，但相比对照组仍有显著差异且 MI 较低。CT3 - DOXSF2/CS2 组因 SF 持续释药，在注射部位周边肿瘤区域诱导出更多凋亡；DOX/CS2 组因药物被邻近组织快速吸收，局部疗效受限，凋亡面积小。CT3 - DOXSF2/CS2 - US 组凋亡水平更高，体现了 CT 声动力疗法与 DOX 控释的协同促凋亡作用。经 SDT 后，CT 纳米颗粒产生的 ROS 会损伤细胞成分、激活信号通路，促使细胞凋亡并增加对 DOX 的敏感性。总体上，CT3-DOXSF2/CS2 和CT3-DOXSF2/CS2 - US 组在高凋亡水平下，MI 和 NP 值低于 IVDOX 组 。

图11 不同治疗组乳腺肿瘤21天后的组织切片分析

结论

本研究旨在设计一种针对乳腺癌的局部联合疗法，以优化治疗效果，并最大限度减少对其他组织的潜在副作用。为实现这一目标，我们使用了一种可注射的壳聚糖（CS）水凝胶，将氧化铜-二氧化钛纳米颗粒（CT）和负载阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒（DOXSFNPs）局部递送至肿瘤部位，用于联合化疗和声动力疗法（SDT）。丝素蛋白纳米颗粒（SFNPs）的粒径为276纳米，对阿霉素（DOX）的负载效率高达95.4%。对水凝胶的物理化学评估表明，添加丝素蛋白纳米颗粒改善了其机械性能和粘弹性，且未对其溶胀或降解产生显著影响。该水凝胶在21天后在体内的降解率为75.87%。体外释放研究显示，在21天内，水凝胶中DOX的累积释放率为78%，这表明该系统能够实现顺序控释。此外，我们发现，在声动力疗法下，CT纳米颗粒在MCF-7细胞中比二氧化钛纳米颗粒（TNPs）产生更多的活性氧（ROS），这体现了铜的催化特性。MTT实验结果显示，与施加超声时相比，负载纳米颗粒的水凝胶的半数抑制浓度（IC50）值更高。另外，与水凝胶组相比，接受超声处理的细胞存活率显著降低（约降低两倍）。我们的体内实验结果证实，负载DOX的纳米颗粒与声动力疗法的联合治疗对减小肿瘤体积的效果更显著，组织病理学分析也显示其有更低的有丝分裂指数。总之，我们将CT纳米颗粒作为声动力治疗剂与DOXSFNPs相结合的联合疗法，为更好地治疗癌症提供了一种有前景的方法。  

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.138910

论文信息

Gao Y, Dai C, Zhang M, et al. Biomimetic Silk Fibroin Hydrogel for Enhanced Peripheral Nerve Regeneration: Synergistic Effects of Graphene Oxide and Fibroblast Exosome.

Maghsoudian, S., Yektakasmaei, M. P., Shaabani, A., et al. Synergistic effects of doxorubicin loaded silk fibroin nanoparticles and Cu-TiO2 nanoparticles for local chemo-sonodynamic therapy against breast cancer. International journal of biological macromolecules, 289, 138910.