摘要

家蚕的丝腺能够合成大量高分子量的丝素蛋白，形成丝素纤维，被认为是一种生物反应器，可将外源蛋白整合进丝素纤维，制备功能性蚕丝生物材料。最近，受益于基因技术的应用，丝腺有望成为大规模生产外源蛋白的生物反应器。Fib-H基因表达系统能够超高效合成丝纤维蛋白，是最有前途的合成外源性蛋白的系统。然而大多数用Fib-H系统表达的外源蛋白水平较低（仅占茧质量的0.95%~6.0%），因此大规模生产仍是挑战。本研究建立了一个高效的Fib-HEXP生物合成体系，利用转基因蚕在丝纤维中合成大量重组RFP，占丝质量的7.86%，实现了荧光丝蛋白（SF）生物材料的制备。通过基因工程葡萄糖氧化酶（GOx）功能化丝纤维验证了Fib-HEXP系统的普适性。制备了葡萄糖/葡萄糖酸/过氧化氢水凝胶，通过葡萄糖酸和过氧化氢的酶催化反应，促进小鼠感染糖尿病创面的愈合。

图1 丝腺生物合成系统实现丝纤维中外源蛋白高效表达和丝纤维基生物材料功能化示意图

研究内容

如图2a所示，为了实现外源基因在家蚕后部丝腺（PSG）中的时空特异性和高效表达，研究者从家蚕基因组中扩增出了一个1967 bp长度的基础Fib-H启动子，将红色荧光蛋白（RFP）的编码序列（CDS）和Fib-H转录终止子（FibHPA）依次连接到基础Fib-H启动子下游，插入pBac转基因载体，形成基本的Fib-HEXP系统（FRFEXP）。为提高FRF的转录效率，研究者在基础Fib-H启动子上游添加一个hr3CQ增强子，形成HFRFEXP系统；为进一步提高外源基因的mRNA稳定性，研究者将FibHPA替换为Ser1PA转录终止子，形成最终的HFRSEXP系统。随后，将以上三个系统微注射到家蚕胚胎中，生成可持续表达RFP的可遗传转基因家蚕。与FRF系统相比，HFRS和HFRF系统表达的RFP分别增加了7.2倍和4.1倍，表明优化后的HFRSEXP实现了天然分子量的重组蛋白在PSG中的高效表达并分泌到丝纤维中（图2c-g）。

图2 Fib-HEXP系统的构建

为提高HFRS系统的茧产量，研究者将其与富含丝胶的棉茧家蚕品系杂交至少5代，以茧大小、颜色、茧壳重量筛选为稳定的生产线，生产大量粉红色蚕丝（图3a-f）。将粉红色蚕丝酶解、层析，可获得纯化纯度超过98%的RFP，剩余的丝纤维可制备再生丝素溶液（图3g-h）。将纯化RFP与再生丝素溶液按所需比例混合可获得RFP-丝纤维溶液，可用于制备RFP荧光纤维薄膜、注射水凝胶、多孔海绵等各种材料（图3i-l）。

图3 利用Fib-HEXP系统合成重组RFP，制备荧光丝生物材料

葡萄糖氧化酶（GOx）是一种结合葡萄糖并催化其转化为葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）的天然酶，被认为是糖尿病创面中抗菌和调节高糖微环境的候选酶。因此对于开发一种能够合成GOx、固定GOx、保持GOx活性，实现可控GOx释放的载体需求很高。为实现GOx在家蚕丝中的高效表达，研究者将黑曲霉GOx成熟肽编码序列根据家蚕的密码子使用偏好进行优化，并插入到HFRSEXP中形成转基因表达载体pBac-HFGOxS（图4a）。随后，将pBac-HFGOxS微注射到家蚕胚胎中，生成可持续表达GOx的可遗传转基因家蚕。获得的蚕丝中GOx含量可达80g/kg，活性达32000U/g蚕丝，GOx稳定性大幅提高（图4c-e）。如图4f-i，研究者将上述转基因蚕与富丝和棉茧蚕品系多次杂交，实现含GOx蚕丝的大量生产（含1.38g GOx/1kg蚕丝，纯度超95%，活性达425U/mg）。

图4 利用Fib-HEXP系统大量合成重组GOx

在葡萄糖存在下，研究者将GOx-silk与细菌共培养，证明GOx-silk能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌附着生长，甚至强于3% H2O2，表明GOx-silk不断催化葡萄糖生成H2O2，形成持续的抗菌效果（图4j-k，图5a-f）。另外，可将GOx从蚕丝中提取出来，不破坏其结构和抑菌作用（图5g-j）。

图5 葡萄糖存在下，GOx-silk的抗菌性能评价

四氧化三铁纳米颗粒能够进一步催化H2O2生成抗菌活性羟基，将其与GOx-silk结合能进一步提高抗菌性。研究者制备了GOx/Fe3O4-SFH水凝胶，光学透明，形态均匀，冻干后具有结构完整，具有3D互通多孔结构，孔径30-90μm，孔隙率超55%（图6a-e）。GOx/Fe3O4-SFH水凝胶吸水能力强，能够快速溶胀，24h溶胀率可达2000%，体外能够快速降解，PBS中8天降解25%（图6f-i）。以上表明该水凝胶适合作为软组织工程的三维基质。水凝胶中引入Fe3O4后，级联催化反应表明GOx能够有效催化葡萄糖生成H2O2，并通过Fe3O4进一步催化H2O2为·OH（图6q）。

图6 抗菌丝素水凝胶的制备

将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养液与GOx/Fe3O4-SFH水凝胶共培养10h，结果表明GOx/Fe3O4-SFH水凝胶能够显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，扫描电镜显示菌体表面不规则、萎缩，表明细菌死亡（图7a-i）。GOx/Fe3O4-SFH水凝胶以100μg/mL剂量处理NIH-3T3细胞，没有明显的细胞死亡，CCK8实验进一步表明GOx/Fe3O4-SFH水凝胶与NIH-3T3细胞具有良好的相容性（图7j-k）。GOx/Fe3O4-SFH水凝胶与红细胞接触后未观察到溶血现象，说明水凝胶具有良好的血液相容性（图7l-m）。

图7 抗菌丝素水凝胶的细菌耐药性、抑菌性和生物相容性

研究者采用糖尿病小鼠模型，如图8a所示，在小鼠背部切除皮肤形成直径8mm的全厚度伤口，金黄色葡萄球菌感染30min后，将GOx/Fe3O4-SFH水凝胶覆盖在伤口上。12天后，GOx/Fe3O4-SFH水凝胶伤口仅剩余11.14%没有愈合，未愈合伤口处几乎检测不到金黄色葡萄球菌（图8b-e）。H&E结果显示伤口处出现相对连续和扁平的上皮细胞，真皮层发育良好，并存在毛囊和皮脂腺（图8f），Masson结果显示胶原纤维交织排列（图8g），免疫荧光结果显示组织中CD31（血管生成标记物）和CD206（M2标记物）显著增强，表明血管生成加速，巨噬细胞从M1型向M2型极化（图9）。综上，GOx/Fe3O4-SFH水凝胶能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而显著促进慢性伤口愈合。

图8 抗菌丝素水凝胶的体内评价

图9 抗菌丝素水凝胶的免疫荧光分析

结论

本研究成功构建了Fib-HEXP系统，实现了具有生物活性外源蛋白的高效表达。利用此系统将PSG和GOx外源蛋白整合到到蚕丝纤维中，RFP功能化丝纤维材料能够证明外源蛋白的生物活性维持，GOx功能化丝纤维能够促进感染慢性伤口的愈合。综上所述，Fib-HEXP系统在遗传学方面为丝纤维生物材料的功能化提供了途径，从而拓宽了丝纤维生物材料的应用。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202414878

通讯作者简介

夏庆友，西南大学教授、博士生导师，西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心 主任，蚕桑重庆市重点实验室 主任，重庆市蚕丝纤维新材料工程技术研究中心 主任，国家重要人才奖励计划特聘教授，国家级人才计划首批百千万工程领军人才，国家自然科学二等奖获得者（第一贡献人），爱思唯尔2019/2020/2021/2022/2023“中国高被引学者”。主要从事家蚕基因组学、功能基因组学、基因组编辑与转基因抗病育种、丝蛋白性能改造、家蚕规模化种质创制、蚕桑现代技术革新等方面的研究。先后主持了“973”、“863”、国家科技攻关、国家自然科学基金重点、国际合作项目等重大研究项目；主持完成家蚕基因组计划、家蚕基因芯片研发、家蚕基因组数据库、家蚕转基因与基因组编辑平台构建等研究，建立人工饲料规模化和工厂化养蚕技术体系。在Science、Nat Biotechnol、PNAS、Genome Biology、JBC等国际著名杂志发表论文500余篇。

文章信息

An Efficient Biosynthetic System for Developing Functional Silk Fibroin-Based Biomaterials[J], Advanced Materials, 2024, 2414878.